1.代謝物提取，一般要求每組至少10個樣；
2.在所有提取好的樣本中取等量混合作為qc；
3.qc樣本與實驗樣本穿插上機，開始十個qc，結尾三個qc，中間每十個樣本穿插乙個qc樣本
。得到質譜譜圖資料經軟體處理後得到峰表。
峰**式一般為：每行為乙個m/z，每列為乙個樣本
數值表示該樣本中某個m/z的訊號響應。
第一列為保留時間_質荷比來代表離子，如0.10_96.9574m/z。
一般有如下幾點：
1.資料預處理。如缺失值過濾填充、資料歸一化等。
2.資料質控。包括cv分布、qc等。
3.統計分析。包括單變數、多變數等。
4.功能分析。包括pathway、網路分析、biomarker篩選等。
1.資料預處理
缺失值處理
1）缺失原因
a. 訊號很低檢測不到；
b. 檢測錯誤，如離子抑制或者儀器效能不穩定；
c. 提峰的演算法限制，不能從背景中將低的訊號提取出來；
d. 解卷積時不能將重疊的峰全部解析出來。
2）缺失值過濾
比如：qc樣本中缺失超過50%的去除；
樣本中缺失值超過80%的去除。
3）缺失值填充
-- 最小值填充
-- 平均值/中值填充
-- knn（ k-nearest neighbour）填充
-- bpca（bayesian pca）填充
-- ppca（probabilistic pca）填充
-- singular value decomposition (svd)
一般推薦knn。
噪音頻號去除
一般是低質量的離子。
1）低質量離子的確定：
計算某個離子在qc樣本中的rsd（標準差/均值）；其值越小，說明偏差越小；
2）判斷標準：
-- 對單個離子峰而言，rsd<0.3，則該離子峰合格，否則去除；
-- 對於整體資料而言，rsd<0.3，峰所佔比例》60%，則整體資料合格；
樣本歸一化
目的是為了提高樣本間的可比性。
樣本間有差異性，如不同人的尿液濃度不同，不能直接拿來比較。
可在採集前歸一化，如肌酸酐歸一化；也可在採集後歸一化，如sum，pqn，quantile等。對於資料分析而言，通常是後者，如總和歸一化（sum）。
資料轉換
下游的分析一般要求資料為正態分佈或者高斯分布；
所以資料通常要進行log轉化或power轉化，這兩者都能夠將極大值的抑制效應消除，並且能夠調整資料的分布，如下圖；
log轉化對0值比較敏感，必須首先去除零值。
資料轉換——scaling
目的是消除極大值效應。
對不同樣本中同乙個m/z的強度差異過大進行調整，極大值的存在往往會掩蓋較低值的變化特徵。
可將某個m/z在所有樣本中的強度的值，除以乙個因子（sd值）；
方法如auto (uv)，pareto（推薦），vast， range等。
相當於上面樣本歸一化是為了樣本可比，scaling是為了離子可比。
qc樣本的tic重疊情況
上圖分別是陰離子和陽離子模式下qc樣本的tic重疊情況。
一般認為：
所有的qc樣本峰重疊良好；
峰強度波動差別不大；
qc樣本中cv<30%的峰所佔比例
pca中qc樣本的聚集程度
qc樣本的相關性
上圖分別為歸一化前和歸一化後的資料。
單變數分析
一次只分析乙個變數，即乙個m/z，考察不同組別不同樣本的這個m/z表達有無差異？
常見的方法有倍數分析，t檢驗，秩和檢驗，方差分析等。
聚類分析
核心思想就是根據具體的指標(變數)對所研究的樣品進行分類；
聚類分析需要設定乙個方法來衡量樣本間的相似性或者不相似性（常用歐式距離，相關性係數等）；
常見聚類的方法：系統聚類（層次聚類）、k-均值聚類等。
k-均值首先要估計出將要分出幾個類，然後將全部的基因按照相似性的距離，歸入這幾類中。
k– means計算量要小得多，效率比層次聚類要高。
無論哪種分類方法，最終要分成多少類，並不是完全由方法本身來決定，研究者應結合具體問題而定。
聚類分析是一種探索性的資料分析方法。相同的資料採用不同的分類方法，也會的得到不同的分類結果。分類的結果沒有對錯之分，只是分類標準不同。
使用聚類方法時，首先要明確分類的目的，再考慮選擇哪些變數(或資料)參與分類，最後才需要考慮方法的選擇。
多變數分析
1）pca分析
以下分別是得分圖（樣本在新的座標系中的位置
）和載荷圖(loading圖，原變數與主成分間的夾角)
pca怎麼看？
2）偏最小二乘法
plsda的圖和pca類似。只是一種監督學習的方法，事先給樣本分類，最後看能否將不同組分開。
用r2和q2進行模型評價。
r2是相關性係數，表示這個模型的擬合效果，是乙個定量的測量（範圍0-1），意味著所建立的模型能在多大程度上代表真實的資料；
一般當r2在0.7-0.8表示模型解釋能力較好，較差的模型的r2往往為0.2-0.3
q2表示pls-da模型的**能力；
一般q2大於0.5表示**能力較好，並且r2與q2的值應該比較接近。
使用permutation test模型進行過擬合檢驗。
vip ( variable importance in projection)變數重要性投影
每乙個m/z都有vip值，表示這個m/z在某乙個主成分上的投影，即重要程度；
一般我們使用第
一、第二主成分的vip來表示這個m/z對模型分型的貢獻程度，vip>=1被認為是具有顯著貢獻的。
代謝組學資料分析最後兩部分內容——功能分析和生物標誌物篩選見下節內容
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