q：要把 qpcr 實驗做，統共分幾步？
a：三步！
q：哪三步？
a：前期準備、中期操作、後期剖析！
一、qpcr 實驗前期準備
前期準備主要是提取、反轉錄和引物設計區域性，我們來逐一分享。
rna 提取留意事項
首先理解一下，rna 抽提準繩：保證 rna 的一級構造、無其它物質的汙染、得率高、掩蓋一切轉錄本。再比擬一下 trizol 提取和試劑盒提取，trizol 提取相對來說耗時長、含有害化學物質、純度低、rna 完好度不高；而試劑盒提取的優點是效率高、純度高、完好度高，各位可依據實踐科研狀況選擇操作辦法。
rna 提取留意事項：
① 運用無 rnase 的塑料製品和槍頭，玻璃器皿要消毒，防止穿插汙染；運用效能較好的移液器，如 eppendorf、thermo 等；
② depc 有劇毒，當心配製；配製溶液應運用無 rnase 的水；
③ 操作人員應戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套；
④ 樣品應防止重複凍融，否則影響提取 rna 提獲得率和質量；
⑤ 若下游實驗對 dna 十分敏感，可用不含 rnase 的 dnase i 對 rna 停止處置。
反轉錄留意事項
秉承防止 rna 被汙染和降解的準繩，依照產品闡明書停止即可，細緻實驗操作以及留意事項可參照之前已推出文章? 乾貨 | 實驗篇之rt-pcr，此文對反轉錄過程的引物設計和留意事項給出了較明白的提示。
qpcr 引物設計留意事項
qpcr 過程中需求運用基因特異性引物擴增，從而剖析目的基因表達量。
① 引薦運用軟體 primer premier 5.0；
② qpcr 過程中運用引物長度引薦 25bp ，擴增產物長度 150bp ，可在 100bp-300bp 之間；
③ 正向引物和反向引物的 tm 值相差不宜超越2℃，tm 值在 60℃-65℃ 之間為佳；
④ 引物鹼基散布要平均，防止呈現連續的4個相同鹼基，gc 含量控制在50%左右，3』端最後乙個鹼基最好為 g 或 c；
⑤ 引物內部或者正反兩條引物間最好防止呈現有3個鹼基以上的互補序列；
⑥ 引物特異性需求用 ncbi blast 程式停止核對。防止引物3』端有2個鹼基以上的非特異性互補；
⑦ 引物設計完成後需停止擴增效率檢測，將擴增效率相同的引物用於定量比擬剖析。
實驗辦法的選擇
兩步法：退火與延伸相同溫度，最高能夠到達72℃（很少採用），常用60℃，此溫度下擴增引物二聚體和錯配等擴增干擾較少，特異性高；每個迴圈時間較短，節約時間本錢。
三步法：合適需求較高退火溫度的引物，取得相對嚴謹的資料。
前期準備終了，我們就能夠停止接下來的實驗了，為了防止踩到坑里，請認真閱讀！
二、qpcr 實驗中期操作
中期操作主要分為試劑的儲存、模板製備、體系配製、實驗程式設定和內參選擇幾個區域性，詳細內容如下：
試劑貯存
-20℃ 避光長期貯存，防止重複凍融，運用前充沛混勻，但要防止產生氣泡。區域性試劑凍結後可能呈現絮狀物質，4℃ 放置並上下顛倒混勻至溶液廓清，不影響試劑效能。
模板的製備
通常 1µg rna 的反轉錄產物需求稀釋10倍左右，以減輕 rna 對 pcr 擴增的抑止。梯度稀釋時，ct 值落在15-28範圍的稀釋倍數作為原始模板稀釋度，在此根底上停止5-10倍稀釋。模板為 cdna 原液時，上樣量不超越 qpcr 反響總體積的1/10。
體系配製
① 請於超淨工作台內配製，並運用無核酸酶殘留的槍頭、反響管；引薦運用帶濾芯的槍頭，防止穿插汙染和氣溶膠汙染。
② 引薦 10μl（q225、novo max100）、20μl、50μl 體系；將引物和 qpcr mix 混合配成大致系，混合平均，為防止誤差，可多配製1-2個加樣孔的量，保證體系穩定性。
③ 通常引物終濃度為 0.2μm，也能夠依據狀況在 0.1-1.0μm 之間停止調整。
實驗程式設定
① 預變性引薦時間5min，依據不同模板和引物的詳細狀況可恰當縮短至2min。此外，依據不同的廠家的產品能夠有對應的預變性時間。
② 退火溫度依據引物和目的基因的長度恰當調整。
③ 儀器需定期校準，此處整理不同 rox 適用機型，給各位小同伴參考。
表1 不同螢光染料對應機型
內參的選擇
內參基因通常指各種管家基因，各類管家基因在生物體各類細胞中都表達。理想的內參基因可在各類細胞或組織、各種實驗條件下恆定表達。但是不同物種、不同組織的管家基因表達存在特異性，目前還未發現完整理想的內參。下表是已報道的區域性物種的 qpcr 內參基因，僅供參考。
表2 已報道區域性物種的 qpcr 內參基因
假如**中的資料無法滿足您的需求，我們再支一招！
如何挑選內參基因？
首先能夠選擇多個內參基因作為校正規範，再者能夠運用 genorm、normfinder 和 bestkeeper 比擬內參基因表達的穩定性，運用軟體 genorm、基因晶元資料和 est 資料庫挑選內參基因。
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