關於蛋白質免疫印跡（western blot，即 wb），想必做蛋白實驗的小同伴們都不會生疏，作為免疫學中最常用的一種實驗辦法，其根本原理是經過特異性抗體對凝膠電泳處置過的細胞或生物組織樣品停止著色。經過剖析條帶大小和著色深度取得特定蛋白質在所剖析的細胞或組織中表達狀況的資訊。
一、訊號強度低
訊號強度低是指在正常**條件下得到的目的條帶微小或是沒有目的條帶，而增加**時間又會招致背景高、雜帶多等問題。掃除試劑質量、操作失誤等方面的影響，這一類問題產生的主要緣由如下：
① 樣本蛋白表達量缺乏。倡議新增蛋白表達量較高的細胞系作為陽性對照，或是恰當增加上樣量以取得較高程度的訊號；
② 蛋白質降解。在蛋白樣品製備期間留意蛋白酶抑止劑 pmsf 的運用，所製備的樣品盡快檢測或妥善保管；
③ 蛋白的轉膜。運用恰當孔徑的膜，同時優化轉膜時間，關於高分子量蛋白可能需求更長的轉膜時間。
④ 抗體的運用。抗體的反響種屬與實驗型別需求可以滿足實驗的需求，此外，抗體的稀釋比、孵育時間等問題也需求在實驗中不時優化；
⑤ 蛋白與抗體分離率低。減少洗膜次數或縮短洗膜時間，降低洗膜液中 nacl 濃度等；
⑥ 抗原被封鎖液遮蓋。換用不同的封鎖液，優化封鎖液中蛋白質濃度並縮短封鎖時間；
⑦ 甲醇濃渡過高。會招致蛋白質與 sds 別離，並沉澱在凝膠中，同時使凝膠收縮或變硬，從而抑止高分子量蛋白的轉移。實驗中可恰當降低甲醇濃度或者運用乙醇、異丙醇替代。
二、非特異性條帶或條帶位置不對
wb 結果中目的條帶之外的條帶被稱為非特異性條帶，有時非特異性條帶很明顯，卻沒有目的條帶，這些狀況對結果剖析會產生很大的干擾。普通來說惹起這類問題的主要要素有：
① 抗體的非特異性分離。通常以為，多抗的特異性不如單抗，更容易產生非特異性條帶，而恰當降低抗體的濃度有助於減少雜帶。同時為了掃除二抗非特異性分離的可能，倡議設二抗陰性對照；
② 樣品蛋白量過高。恰當降低上樣量，同時延長洗濯時間與封鎖時間可防止蛋白量過高對實驗結果的不良影響；
③ 蛋白質降解。會招致條帶位置變化並產生更多雜帶，倡議採用新穎製備的或是凍融次數較少的樣品；
④ 細胞傳代次數過多。會招致蛋白表達形式的分化，倡議運用原始或傳代少的細胞株；
⑤ 蛋白存在複合物。有的目的蛋白會和其他蛋白分離構成複合物，招致條帶位置改動，需求查閱相關文獻來肯定蛋白能否會構成穩定複合物；
⑥ 蛋白存在剪接體或多種修飾方式。區域性蛋白存在剪下位點，有的剪下體具有免疫活性，在 wb 中也會被檢測出。此外有的目的蛋白會存在醣基化位點或其他修飾位點，條帶大小可能會遠超理論分子量。因而需求查閱文獻或是 uniprot 來得知蛋白的剪下體大小以及修飾位點等。
① 封鎖不充沛。背景過高的主要緣由之一是封鎖有問題，倡議運用適宜的封鎖劑（脫脂奶粉、bsa 等），優化反響濃度與封鎖時間，同時留意防止呈現抗體與封鎖劑的穿插反響，以及封鎖劑與含有目的抗原，內源性生物素或者與抗生物素蛋白/鏈黴親和素不相溶等問題；
② 洗膜不充沛。恰當增加洗膜次數弛緩衝液體積，進步吐溫20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的問題；
③ 抗體的運用。一抗濃渡過高是高背景的緣由之一，且二抗也存在與封鎖劑非特異性分離的可能，因而倡議恰當優化一抗濃度，並設二抗陰性對照；
④ **時間長。倡議在實驗中採用適宜的**時間。
四、條帶瀰散或外形怪異
有時 wb 結果圖中條帶位置契合預期，但卻由於條帶瀰散、外形怪異等要素招致無法運用，呈現這種狀況多半是制膠或電泳過程出了問題，詳細如下：
① 電泳時電壓、電流過高。會招致條帶遷移速率過快以及 sds-page 溫度公升高，並可能使得條帶瀰散、外形變形。倡議運用適宜的電泳條件並堅持低溫；
② 電極不均衡。會招致條帶偏斜，上樣時在無樣品的膠孔中參加等量樣品緩衝液可防止這種狀況；
③ 上樣量過高，樣品中鹽離子濃度較大。上樣量過高可能會招致條帶瀰散，樣品中的鹽離子濃度不分歧則會招致條帶不齊等問題。因而在上樣時需保證樣品量分歧且恰當，並堅持相同的、較低的鹽離子濃度。
④ 制膠問題。在配膠時一定要保證充沛混勻，平均凝膠，上樣前用針頭將膠孔撥正並吹出膠孔中的氣泡。
⑤ 電泳緩衝液寄存過久。電泳實驗中的緩衝液假如放置過久也會對結果有不良影響，因而倡議及時改換新的緩衝液。
五、膜上分布不平均的汙點
有時在 wb 做出結果後，除了目的條帶以外，膜上還散布著不規律的汙點，對結果也會有較大的干擾。這類問題產生的主要緣由有以下幾點：
① 試劑、儀器等汙染。倡議在每次實驗前後留意清算實驗儀器，同時及時改換呈現問題的試劑；
② 轉膜時有氣泡。確保在轉膜過程中將氣泡掃除潔淨；
③ 抗體孵育時與膜接觸不充沛。確保在抗體孵育過程中，液體總量足夠，同時將抗體平均配置，並在搖擺的條件下停止孵育；
④ **時間。過度**會招致斑點更明顯，倡議採用適宜的**時間；
⑤ 膜枯燥。實驗中要保證有充沛的反響液，防止呈現乾膜現象。
以上就是本次分享的全部內容，看完這一大堆之後是不是覺得頭都大了？那麼有沒有什麼辦法可以簡單、省心還能得到好的實驗結果呢？
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