層析柱是層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。根據樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配係數不同，從而分離的一種層析法。選柱子：有玻璃柱和不鏽鋼柱兩種，實驗室常用玻璃柱。徑高比一般在1:5-10。根據吸附劑用量（體積)確定柱子大小，一般吸附劑應填充到柱子體積的1/4-1/5。
灌柱子方法
柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。
壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數。其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，乙個柱子幾個月也是有的。
減壓柱能夠減少矽膠的使用量，感覺能夠節省一半甚至更多，但是由於大量的空氣通過矽膠會使溶劑揮發（有時在柱子外面有水汽凝結)，以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水幫浦抽氣（很大的噪音，而且時間長)。
加壓柱是種比較好的方法，與常壓柱類似，只是外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或小氣幫浦。特別在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。
柱子的尺寸為粗長的最好。柱子越長，相應的塔板數就越高。柱子越，上樣後樣品的原點就越小（反映在柱子上就是樣品層比較薄)，這樣相對的減小了分離的難度。
無水無氧柱適用於對氧、水敏感，易分解的產品。可以溼柱，也可以乾柱。不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次，因為溶劑和矽膠飽和時放出的熱量有可能使產品分解，畢竟要分離的是敏感的物質，小心不為過。因為分離的物質比較敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至於是加壓、常壓、減壓，隨需而定。因為是schlenk操作，所以點板是個問題，如果樣品是顯色的，恭喜了，不用點板，直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色，只好準備幾十個schlenk瓶，一瓶一瓶的點，不過幾次之後就知道樣品在哪，也就可以省些了。
無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。因為矽膠中有大量的羥基裸露在外，很容易是樣品分解，特別是金屬有機化合物和含磷化合物。而氧化鋁有鹼性、中性和酸性的，選擇餘地比較大，但比矽膠要貴些。聽說有個方法，就是用石英做柱子，然後用hf254做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產品在**了，沒有驗證過。
選擇吸附劑：200-300目矽膠，稱30-70倍於上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的矽膠。幹矽膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g矽膠，用燒杯量100ml也可以。
推薦矽膠量是樣品量的30-40倍，具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質分的比較開(是指在所需組分rf在0.2-0.4，雜質相差0.1以上)，就可以少用矽膠。
用矽膠作固定相過柱子的原理是乙個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與矽膠的吸附比較強的話，就不容易流出。這樣就會發生，後面的點先出，而前面的點後出。這時可以採用氧化鋁作固定相。
常用吸附劑的種類：氧化鋁、矽膠、聚醯胺、矽酸鎂、滑石粉、氧化鈣（鎂)、澱粉、纖維素、蔗糖和活性炭等。
幾種常見吸附劑的特性
（1)氧化鋁：市售層析用氧化鋁有鹼性、中性和酸性三類，粒度規格大多為100-150目。
鹼性氧化鋁（ph9—10)：適用於鹼性物質（如胺、生物鹼)和對酸敏感的樣品（如縮醛、糖苷等)，也適用於烴類、甾體化合物等中性物質的分離。但這種吸附劑能引起被吸附的醛、酮的縮合。酯和內酯的水解、醇羥基的脫水、乙醯糖的去乙醯化、維生素a和k等的破壞等不良副反應。所以，這些化合物不宜用鹼性氧化鋁分離。
酸性氧化鋁（ph3.5—4.5)：適用於酸性物質如有機酸、氨基酸等以及色素和醛類化合物的分離。
中性氧化鋁（ph7—7.5)：適用於醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在鹼性介質中不穩定的物質如酯、內酯等的分離，也可以用來分離弱的有機酸和鹼等。
（2)矽膠：矽膠是矽酸的部分脫水後的產物，其成分是sio2·xh2o，又叫縮水矽酸。柱色譜用矽膠一般不含粘合劑。
適用範圍：非極性和極性化合物，適用於芳香油、萜類、甾體、生物鹼、強心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸，及一系列合成產品如有機金屬化合物等。
（3)聚醯胺：色譜用聚醯胺主要有錦綸6（聚己內醯胺)和錦綸66（聚己二醯己二胺)兩種，分子量一般在16000-20000，其親水性和親脂性均較好，因此既可分離水溶性成份，也可分離脂溶性成分。
可溶於濃鹽酸、甲酸及熱的乙酸、甲醯胺和二甲基甲醯胺中；微溶於乙酸和苯酚等；不溶於醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；對鹼穩定，對強酸可水解。
聚醯胺色譜的原理：兼具吸附色譜和分配色譜的功能。
採用強極性洗脫劑時主要為吸附色譜——正相色譜；
採用弱極性洗脫劑時主要為分配色譜——反相色譜。
分離物件：能與聚醯胺形成氫鍵的化合物，如酚類、酸類、醌類、硝基化合物及含羥基、氨基、亞氨基的化合物及腈和醛等類化合物。
聚醯胺在水中吸附能力的規律：
形成氫鍵的基團(如酚經基、按基、酪基、硝基等)越多，吸附力越強。如丁二酸＞丁酸 形成氫鍵的位置與吸附力有很大關係。對位、間位酚羥基使吸附力增大，鄰位使吸附力減小。芳香核、共軛雙鍵多者吸附力大，少者吸附力小。若形成分子內氫鍵，則使化合物的吸附力減小。
（4)矽酸鎂：中性矽酸鎂的吸附特性介於氧化鋁和矽膠之間，主要用於分離甾體化合物和某些醣類衍生物。為了得到中性矽酸鎂，用前先用稀鹽酸，然後用醋酸洗滌，最後用甲醇和蒸餾水徹底洗滌至中性。
裝柱子的技巧
柱層析的裝柱非常重要，裝柱的效果會直接影響層析分離效果。有濕法裝柱和乾法裝柱等兩種方法。濕法裝柱很簡單，使用也最普遍， 就是先用比固定相多一倍的洗脫劑將固定相活成勻漿，柱子底部先用脫脂棉塞緊， 然後倒入洗脫劑將脫脂棉中氣泡趕出。
用漏斗將活好的固定相倒入柱子中， 開啟底部活塞， 將柱子中高出固定相的溶劑放出。期間不斷用橡皮棒敲打， 將固定相敲實， 做到密實均勻無氣泡即可。
很多時候用加壓的方法可以很高效地裝好柱子，而且在柱子中沒有氣泡產生。
乾法裝柱與濕法裝柱剛好相反的是，它是將乾燥的吸附劑從柱子上端直接加入到乙個空的柱子中， 然後用油幫浦抽柱子底部， 相當於減壓過柱， 直到柱子變得很結實， 再用淋洗劑「走柱子」 。
乾法裝柱的乙個缺點就是在裝入洗脫劑後， 由於溶劑和固定相之間的吸附放熱， 所以柱子容易變花，影響分離效果。
解決的方法是：
（1）固定相一定要新增結實；
（2）一定要用較多的溶劑「走柱子」，直到柱子的下端不再發燙， 恢復到室溫後再撤去壓力。無論使用哪種方法裝柱，最後都要求所裝的柱子結實、勻稱、無氣泡。
上樣的技巧
上樣也有濕法和乾法之分：濕法一般用淋洗劑溶解樣品， 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等， 但溶劑越少越好。再用膠頭滴管轉移得到的溶液，沿著層析柱內壁緩慢地均勻加入。
在不用海沙的情況下， 盡量不要破壞矽膠面。加樣後， 開啟柱底活塞， 讓固定相充分地吸附所加樣品。然後再加入一些洗脫劑，再充分地吸附後將一團脫脂棉塞至接近矽膠表面。
然後就可以放心地加入大量洗脫劑， 而不會沖壞矽膠表面。很多樣品在上柱前是粘乎乎的， 一般沒關係。有的時候上樣後在矽膠上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會出現， 是因為矽膠對樣品的吸附飽和， 而樣品本身又是比較好的固體才會析出， 這就需要先重結晶樣品， 得到大部分的產品後剩餘的產品再柱分。
如果不能重結晶也沒關係，直接過柱就行， 樣品會隨著淋洗劑流動而慢慢溶解， 最後隨著洗脫劑流出。有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如 dmf，dmso等， 會隨著溶劑一起走， 顯色是乙個很長的脫尾） ， 這時就必須用乾法上柱了。
乾法過柱是把待分離的樣品用少量溶劑溶解後，在加入少量矽膠， 拌勻後再旋去溶劑。一般樣品和矽膠按 1：1 的量混合， 矽膠使用的量也可以少一些， 但是要保證在旋乾後， 不能看到明顯的二類醫療器械註冊檢驗固體顆粒，讓樣品都吸附在矽膠的表面上。然後小心地加入到裝好的柱子中， 加入洗脫劑洗脫。
過柱的技巧
柱層析按過柱時的壓力可以分為：加壓， 常壓， 減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動速度， 減少產品收集的時間， 但是會減低柱子的塔板數。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的， 但是時間也最長， 例如一些天然化合物的分離，有時乙個柱子過幾個月也有可能。
減壓柱能夠減少矽膠的使用量，但是由於大量的空氣通過矽膠會使溶劑揮發， 有時會在柱子外面有水汽凝結， 另外有些比較易分解的東西可能得不到， 而且還必須同時使用水幫浦抽氣， 噪音大， 時間長， 所以減壓過柱用得比較少。
加壓過柱是一種比較好的方法， 與常壓柱類似， 但用外加壓力可以使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣幫浦 （用魚缸供氣的加壓幫浦就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中很適用。
一般壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。因為加壓過柱效率高， 分離效果較好， 所以加壓過柱在普通的有機化合物的分離中是非常適用的。
一些低沸點溶劑裝柱時往往會在柱子中產生氣泡， 使柱子變花， 利用加壓過柱法在裝柱時就可以有效地解決這個問題， 而且可以使柱子很快裝實。
隨著科技的發展， 色譜法的技術也日新月異， 但柱層析實驗技術還是比較簡單和實用的， 每個科研工作者在使用柱層析時， 可以根據自己的實際情況來不斷地摸索，不斷地總結和提高柱層析的實驗技術。
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