引物設計的下列原則供您參考：
常用的軟體有oligo 6和primer premier 5.0。引物設計軟體是根據引物設計的指導意見設計而成。其實，pcr擴增的成敗最關鍵的是反應模板的製備和反應條件的控制。引物設計軟體的缺點是，有時判斷為該基因沒有一段區域滿足標準引物的要求。
通常國外的文獻可信度比較高，可直接使用；但為了保險起見，最好用blast對引物探針的序列進行必要的驗證；或者再進一步用引物設計軟體對引物探針的二級結構和退火溫度進行分析，這樣更有利於您對整個實驗的把握。
tm值的概念：
dna熔解溫度，指把dna的雙螺旋結構降解一半時的溫度，亦即dna 變性過程中，紫外吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為 dna 的解鏈溫度(tm)。
金斯瑞採用以下方法計算tm值：
長度為20mer及以下的引物，tm計算公式為：tm = 4℃(g + c)+ 2℃(a + t)。但這個公式只適用於14~20個鹼基的引物，引物的tm值還與引物長度、鹼基組成、引物使用緩衝溶液的離子強度等有關。
對於更長的寡聚核苷酸，tm計算公式為：tm = 0.41(% of gc) – 675/l + 81.5
注：l：引物鹼基數；% of gc：引物gc含量；% of gc = gc個數/引物總鹼基數
主要因為是修飾單體穩定性較差，偶聯時間長，效率低，最後得到的產量自然低於一般的引物。修飾引物通常需要page或hplc純化，純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產品的**自然高。
螢光探針儲存方法如下：
螢光染料引數
縮寫全名
吸收波長
發射波長
顏色6-fam
6-carboxy-fluorescein
494nm
518nm
green
tet5-tetrachloro-fluorescein
521nm
538nm
orange
hex5-hexachloro-fluorescein
535nm
553nm
pink
tamra
tetramethyl-6-carboxyrhodamine
560nm
582nm
rose
rox6-carboxy-x-rhodamine
587nm
607nm
redcy3
indodicarbocyanine
552nm
570nm
redcy5
indodicarbocyanine
643nm
667nm
violet
5-fam、6-fam、fitc標記都是螢光素標記 (fluorescein)，5-fam與6-fam互為異構體。它們的髮色團均為螢光素，通常使用中沒有區別。
fam通過醯胺鍵與oligo連線，而fitc通過硫脲鍵與oligo 連線，fitc上的 -scn 與-nh2反應過程如下：
下圖是3'fitc和3'fam與引物連線後的效果圖，5'fam和5'fitc的連線方式與此相同。
由淬滅基團tamra、eclipse或bhq系列染料組成的雙標記螢光探針常常被用作水解探針(hydrolysis probes)，或稱taqman探針，用於實時螢光定量pcr實驗。
1) tamra為螢光染料，在淬滅報告基團的同時，會在更高波長處發射螢光。而eclipse及bhq系列為非螢光染料，淬滅報告基團時，自身不發射螢光，探針螢光本底比tamra低，檢測靈敏度更高。
2) tamra的吸收光譜覆蓋範圍窄，可與之匹配的報告基團種模擬較少；而eclipse則具有更寬的吸收範圍(390nm-625nm)，可淬滅的報告基團種類很多，如fam、hex、tamra、rox等均可；組合使用的bhq系列染料的吸收光譜覆蓋範圍則更廣，從430nm一直到近紅外，可淬滅的報告基團種類更多，包括cy3、cy5等。因此可由eclipse或bhq系列染料組成一套雙標記螢光探針用於多重pcr。
下列原則可供您參考：
有些螢光基團在260nm處也有吸收光，例如 fam, hex, tamra, tet。其它在260nm處可能也有吸收值，但是資料沒有公布，因此計算時不包括在裡面。
5'磷酸化作用是通過b-氰乙基化學反應新增到引物5'端的糖環上，而不是最後乙個鹼基上；3'磷酸鹽被連線到固體支援介質上，所以在合成的第乙個迴圈，鹼基就與它偶聯。3'磷酸化修飾具有阻止聚合酶延伸的功能。
s-oligos是寡核苷酸中的單核苷酸之間的磷酸二酯鍵中的乙個氧被硫代替後形成的。這種修飾是在連線的時候進行的（不是在合成後進行的）。鹼基被新增上後，再進行連線修飾。在兩個鹼基之間的磷酸可以轉換成雙鍵"s"(用硫代試劑）代替普通的雙鍵"o"（用碘溶液），和磷酸二酯鍵相連的鹼基都可以進行這種修飾。
但3'末端鹼基不能進行硫代磷酸化修飾，因為從固體支援物上解離下來時，磷酸酯鍵不存在了，3'末端鹼基是oh。我們可以提供對s-oligo進行5'修飾，如客戶可以定製s-oligo的螢光素標記。s-oligo和普通的寡核苷酸在page膠上的位置是一樣的。
5'aminolinker(c6)是在合成迴圈的最後一步以亞磷酸胺的形式通過b-氰乙基化學反應新增到引物5'糖環上的，而不是新增到最後乙個鹼基上。
5'氨基標準的偶聯效率是》95%,氨基基團在260nm處是沒有吸光值的；它在210nm處有吸光值。不能通過電泳檢測它的存在（瓊脂糖或丙烯醯胺）。
3'aminolinker(c7)只與一些5'修飾相容，如fam, hex, tet, fluorescein, biotin, amine, and phosphate。其它的5'修飾(如alexa dyes)需要氨基才能與寡核苷酸相連，這就無法避免該染料與3'氨基相連。
氨基修飾是很簡單便宜的方法。任意一種氨基修飾都可以。5'末端c6型別效果很好。
fam, hex and tet是在合成迴圈結束時以亞磷酸胺的形式通過b-氰乙基化學作用新增上的，因此是新增到引物的5'末端的糖上而非引物的末端鹼基。它們通過磷酸二酯鍵共價連線到5'端最末的糖環上。
在液體中的顏色：hex是粉紅色，fam是黃色，tet是橙色
經過這些修飾的寡核苷酸不能進行硫代磷酸化修飾。
mwemission(nm)
excitation(abs)max(nm)
extinction(at max)
extinction(at 260)
fam554.5
517494
74,850
20,960
tet692.2
538522
85,553
16,255
hex761.1
553535
95,698
31,580
注：摩爾消光係數是在最大nm處的激發光下測得的。因為ph或成分的微小變化可能會影響以上的資料。
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