開發scrna-seq的新實驗方法和操作手冊是目前很火的研究領域，而且最近這些年已經發表了一些改進方法。上圖可以看出檢測的細胞數目以指數形式增加，以下是乙份不完全的列表：
總體流程如下圖所示：
這些方法可以用不同的方式分類，但兩個最主要的優化是：定量和捕獲。
定量有兩種型別—-全長型和標籤型 (tag-based)。全長型力圖捕獲並均勻測序整條轉錄本，標籤型只捕獲轉錄本的5'或3'端。不同定量方式需要自己對應的計算分析方法。全長方案理論上可以對整個轉錄本進行均勻測序，但實際上總會有測序覆蓋偏好性的存在。標籤型的主要優點是可以與唯一的分子識別符號(umis)結合進行更精確定量 (後面詳細描述)。其缺點是，測序限制在轉錄本的5'或3'端，可能會降低比對率，並且難以區分不同剪接體的表達。
捕獲的策略決定了實驗通量、細胞如何被選擇和除測序外的哪些額外資訊可獲得。最常用的三種捕獲方式是基於微孔- (microwell-)，微流- (microfluidic-)，液滴- (droplet-)，細分如下圖所示。
對於基於微孔的捕獲平台，先用移液管或者雷射切割的方式分離細胞並放到微流孔中。它的乙個優點是可以結合流式細胞螢光分選（facs, fluorescent activated cell sorting）根據表面marker分選細胞。因此特別適合分選細胞子集用於測序。另乙個優點是可以獲得細胞形態全覽圖，提供多乙個維度的資訊，可用於鑑定微孔中是否有損傷的細胞或雙份細胞，主要缺點是通量低且每個細胞所需的工作量相當大。
微流型平台，比如fluidigm』s c1，提供了乙個更加整合的系統，同時可以捕獲細胞和完成文庫構建的準備過程。因此它們比微孔型平台通量更高。但是微流型平台大約只能捕獲10%的細胞，不適合處理稀有細胞或者細胞量很少的情況。此外，微流控晶元相對昂貴，不過更小的反應體積可以節省試劑的費用。
液滴型方法是將單獨的細胞和乙個包含建庫所學酶的珠粒 (bead)包裹在乙個奈米級液滴裡面。特殊地，每個珠粒(bead)包含一段獨特的條形碼序列 (barcode)，會加到所有來自於液滴裡面這個細胞的序列上，用於區分不同細胞的轉錄本。因此所有的液滴可以混合在一起測序，然後再根據barcode序列確定其是否歸屬於同一細胞。液滴型平台通常有最高的通量，因為文庫的準備成本很低，約為0.05美元/每個細胞。隨之而來的，測序成本往往是其限制因素，通常測序深度比較低，只檢測幾千個轉錄本的表達。
microwell-seq是浙江大學郭國冀老師研究組綜合以上技術的優勢開發出的新的大規模低成本單細胞捕獲測序技術，單個細胞製備成本可以到0.02美元。
採用光刻技術製作微孔矩陣矽片（微孔直徑28 um，深度35 um，100,000個微孔），以此為模具製作pdms微柱模具。這兩個模具可以反覆使用。最終用於富集的微孔板是通過傾到5%的瓊脂糖凝膠到pdms微柱模具上生成的。細胞懸液加到凝膠微孔模具上，利用重力使細胞落入微孔，通常乙個微孔只能容納乙個細胞，一塊板子可以同時捕獲約10000個單細胞。每一步操作都可視、可控制，doublets可以通過鏡檢洗除。隨後每個空加入包含107-108特定探針集的與孔徑大小匹配的磁珠，標記每個細胞中的mrna（每個磁珠的寡核苷酸序列中都有一段特異的序列用於標記細胞**），然後使用smart-seq2方法進行後續的反轉錄、擴增。擴增後的cdn**段使用轉座酶片段化(這步倒有些類似atac-seq)，富集3』末端轉錄本序列測序。
平台選擇取決於手上的生物問題，舉個例子，如果乙個人對描述組織的細胞型別構成感興趣，能夠捕獲大量細胞的液滴型平台很可能是最合適的，而如果感興趣的是有已知的表面marker的稀有細胞群體，那最好用流式細胞facs分選法富集細胞並對少量細胞進行測序。
如果對研究不同剪接體的表達感興趣，全長轉錄本定量會更適合。相反，umis只適用於tagged protocol，更有利於穩定定量基因水平的表達。
enard團隊和teichmann團隊的最近兩項研究對幾種不同單細胞分選和建庫方案進行了比較，ziegenhain等用同一種老鼠胚胎幹細胞 (mescs)比較了五種不同方案。通過控制細胞數量和測序深度，作者能直接比較不同方法檢測敏感性，噪音水平和費用差異。他們的乙個結論如下圖，不同方法檢測到的基因數量 (檢測閾值固定)差別挺大。如圖所示，drop-seq檢測到的基因數目最少，和smart-seq2檢測到的基因數差了近乎兩倍，意味著不同方案的選擇對研究影響很大。
svensson等人則採用了一種不同的方法，即通過使用已知濃度的合成轉錄本 (spike-ins, 後面詳細介紹)來評估不同方****性和敏感性。通過廣泛比較同樣發現不同的細胞分離建庫方式差別較大。bulk測序的準確性和敏感性相對最好，其它方法準確性高的，敏感性就會差一些。
隨著實驗操作技術的發展和計算方法的改進，後續研究可以幫助我們進一步了解不同方法的適用優缺點。這些比較研究不僅有助於研究人員決定使用哪種方案，而且可以通過基準測試確定哪個方法組合最有效來研發新的單細胞實驗和計算方法。
國內高通量植物單細胞轉錄組文章
三個關鍵字，國內，高通量和轉錄組 乙個網頁工具 2019年4月18日，國內第一篇植物根部單細胞轉錄組文章在 molecular plant 發表，題為 a single cell rna sequencing profiles the developmental landscape of arabi...
單細胞動物的快樂。
最近感覺自己身邊的氣氛或許有些凝重，自己的朋友或多或少高興的不是太多。連我最好的朋友鬱悶一陣子了。很想安慰他，在我很需要幫助的時候他幫過我很多，但是真要去安慰他，我有不知道該怎麼說。最近也和另一為朋友在一起的時間比較多，他的心情當然也不是很好。也許我想安慰他，但我發現似乎他說的得時間比較多。我進來的...
單細胞轉錄組測序技術及各類資料分析方法總結
自從2009年單細胞轉錄組測序 single cell rna seq，scrna seq 技術首次問世，至今已經有幾十種不同的scrna seq技術相繼被開發出來。在過去的十年裡，單細胞轉錄組測序技術得到了蓬勃的發展，從而使得可在單細胞水平揭示全基因組範圍內所有基因的表達情況，可以更精準的開展細胞...