轉錄組測序

資料分析與解讀

1. data cleaning

從原始資料（raw data）到乾淨資料（clean data）的過程，有人翻譯成「資料清洗」，實在叫不習慣

illumina測序儀下機的資料通常為bcl格式，是將同乙個測序通道（lane）所有樣品的資料混雜在一起的，所以公司一般不會提供bcl檔案。測序公司使用illumina官方出品的bcl2fastq軟體，根據index序列分割轉換成每個樣品的fastq檔案，開啟長這樣：

原始資料沒法直接分析，是因為部分reads測序質量較低，可能會誤導後續結果，因此需要對低質量鹼基太多或n（未能識別的鹼基）太多的reads進行去除；此外，部分測序文庫的插入片段太短，導致測到兩側的接頭序列，這些序列接頭也需要從reads中去除。最後，我們也會對清洗前後的raw data和clean data進行評估，評估內容包括鹼基質量、序列長度、鹼基比例、gc含量、重複序列、kmers等

#常用軟體#

我以前都是用cutadapt + fastx-toolkit的組合，直到同事們給我推薦了trim galore，質量評估使用fastqc

1.5 #可選步驟# 核醣體rna（rrna）去除

2. 比對

如果不是很急或者只想知道已知轉錄本表達量，個人建議使用基因組比對的方法進行分析，理由如下：

① 轉錄組比對需要準確的已知轉錄本的序列，對於來自未知轉錄本（比如一些未被資料庫收錄的lncrna）或序列不準確的reads無法正確比對；

② 與上一條類似，轉錄組比對不能對轉錄本的可變剪接進行分析，資料庫中未收錄的剪接位點會被直接丟棄；

③ 由於同乙個基因存在不同的轉錄本，因此很多reads可以同時完美比對到多個轉錄本，reads的比對評分會偏低，可能被後續計算表達量的軟體捨棄，影響後續分析；

④ 由於與dna測序使用的參考序列不同，因此不利於rna和dna資料的整合分析。

此外，值得注意的是，rna測序並不能直接使用dna測序常用的bwa、bowtie等比對軟體，這是由於真核生物內含子的存在，導致測到的reads並不與基因組序列完全一致，因此需要使用tophat/hisat/star等專門為rna測序設計的軟體進行比對

比對結果會展示為bam/sam檔案，其中bam格式是sam格式的二進位制版本

bam檔案中每行代表一條reads的比對資訊，其中第一列是read的id，第二列為flag（包括是否雙端比對，比對位點是否唯一等資訊），第三列為比對的染色體，第四列為比對的起始位置，第六列為cigar值，代表比對的具體方式（例60m2d80m代表60個鹼基完美匹配+2個鹼基缺失+80個鹼基完美匹配）等等

#常用軟體#

基因組比對：

tophat2：可以說是最被公認的rna測序比對軟體（實際上是在dna比對軟體bowtie的基礎上做了乙個殼），相信很多做rna測序的同學都是看著tophat發表在nature protocol上的步驟一步步入門rna測序的；

hisat2：tophat2的非正式公升級版本（因為據說還會有tophat3），在tophat的演算法基礎了上做了大量的改進，而且克服了tophat最大的缺點——速度慢，nature protocol上同樣發表了操作流程；

star：encode計畫御用比對軟體，權威程度可以與tophat平起平坐，並且比對速度極快；

mapsplice：tcga使用的比對軟體，我自己沒用過；

rsem：rsem更像乙個軟體包而不是乙個比對軟體，能夠提供從比對到計算差異表達的所有步驟，由於不需要自己寫**串聯不同軟體生成的資料格式，因此用起來比較省時省力，值得注意的是，tcga使用mapsplice比對後再用rsem計算表達量，並沒有直接只用rsem原裝的bowtie的比對結果。

轉錄組比對：這型別的軟體我用的不多，最近嘗試過nature methods上面發表的salmon，能從clean reads直接算到表達量，優點是，快，非常快。然而這個軟體連bam檔案都沒生成，雖然只是定量的話bam檔案的確沒什麼用就是了…

轉錄組測序

轉錄組測序

轉錄組測序流程

使用RSEM進行轉錄組測序的差異表達分析

轉錄組測序

轉錄組測序

轉錄組測序流程

使用RSEM進行轉錄組測序的差異表達分析

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