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具體操作步驟如下：
1．無菌條件下取材（術中切除的全層軟骨片），於含無血清的dmem培養液的無菌容器中儲存，低溫下轉移（冰盒），移入超淨工作台，pbs沖洗3次。剪去非軟骨組織如滑膜組織或纖維結締組織。
2．收集全部軟骨，移入50ml離心管中。用10mlpbs洗軟骨組織碎塊2－3遍。在離心管內再加入新鮮的0.25％的胰蛋白酶（10ml/g），37培養箱中消化30－45min（最好在攪伴狀態下），以除去可能附著的成纖維細胞。加入等量的10％dmem終止消化，吹打後去除胰蛋白酶和成纖維細胞，再各用10mlpbs清洗兩遍。
3．將軟骨移入培養皿，倒入pbs淹蓋標本為止，用無菌刀片將軟骨片切成1mm3大小的碎粒，移入第二個50ml離心管中，pbs淹蓋，沖洗3次。（標本要稍多一點，至少大於300mg試驗取1g左右，軟骨塊要盡量切碎，便於消化）
4．加入5ml的0.2％的ii型膠原酶，37培養箱中消化4-6h,其中2h後每隔20min晃動離心管一次，觀察軟骨塊基本被消化，懸液變混濁。（ii型膠原酶消化4-6h見懸液變混濁，表明已有軟骨細胞消化下來，可先收集，未消化完的的軟骨碎粒可繼續消化，0.1％的ii型膠原酶過夜約18－24h）
5．120目濾器過濾收集懸液（用pbs沖洗濾器底和皿底盡可能收集所有細胞），徹底打勻成團的細胞。
6．1000r/min離心10min，棄上清液，pbs重懸3次，相同條件再離心，棄上清液去除膠原酶，收集細胞。
7．加入10％dmem培養液1ml，吹打均勻後移入10cm培養皿中，補足培養液至10ml。（吹打後可行計數板計數及台盼蘭活性檢測，或以2.5x104/cm2的比例置於培養皿中。）
8．48h後首次換液去除未貼壁的細胞。
9．置於37 5％co2培養箱內繼續培養，每隔3－4d換液1次，倒置顯微鏡下觀察拍照。
10．細胞長滿近融合時用0.05%胰蛋白酶－0.02%edta消化2－3min，1200r/min離心5min，棄上清液，計數，按1：3或1：4傳代。（推薦1：2傳代）如果組織量多，可重複4－8步驟。
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