一、嚴格無菌操作
對實驗室以及培養過程中所接觸的試劑、液體、器皿、儀器的消毒,均應嚴格按照有關細胞培養的參考書的要求進行操作。無菌觀念要貫穿整個實驗的始終,不可鬆懈。
二、培養器皿的選擇
淋巴細胞培養既可選擇培養板(24 、48 、96 孔) 、培養瓶,也可選擇三角燒瓶、試管等器皿進行培養。有研究表明提取的淋巴細胞用1. 5ml 離心管培養72 小時,細胞生長狀況良好,細胞數與培養前比較,差異無統計學意義( p >0. 05) 。用青黴素小瓶進行培養,淋巴細胞生長也非常好。
可以認為,對散在的細胞培養來說,用小器皿具有以下優點:
(1) 便於操作:1. 5ml 離心管為一次性使用,青黴素小瓶可反覆刷洗,而培養板、培養瓶**偏貴且用過幾次之後,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更為重要的是,淋巴細胞培養為懸浮培養,在培養過程中需要不斷晃動,而大多數實驗室沒有恆溫搖床。我們發現,在培養過程中每隔6～8小時晃動一次培養器皿,便可解決這個問題。青黴素小瓶、1. 5ml 離心管晃動起來相對容易些。
(2) 減少汙染:因為淋巴細胞培養的液體量較少,一般為100～ 200μl , 故文獻資料中多見用培養板( 48 、96孔) ,少見用培養瓶。對分散的淋巴細胞培養,一方面一次用不了那麼多孔,另一方面一旦一孔有汙染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培養也失敗。而且,晃動培養板時,很容易使液體濺到培養板蓋上,增加汙染的機會。而使用青黴素小瓶、1. 5ml 離心管等小器皿便可避免這些現象,但缺點是不易觀察細胞生長,需取樣加到載玻片上觀察。
三、血清的選擇
淋巴細胞對血清的要求較高,所以選用血清時要注意生產廠家。但胎牛血清**昂貴,新生小牛血清或小牛血清也**不菲,而使用自身血清不僅細胞長得好,而且更接近體內環境,避免了外來因素的干擾,使實驗設計更嚴密。血清濃度在5 %～20 %時細胞生長比較好,當超過30 %時反而不利於細胞生長。
四、ph 值
細胞生長的最適ph 為7. 0～7. 2 ,可忍耐的ph 範圍為6. 6～7. 8 ,當ph 低於6. 8 或大於7. 6 時, 都會抑制細胞生長 。 rpmi1640 培養基加入血清後ph 值一般公升高0. 2～0.4 ,故配1640 培養液及其他用液時使ph 值達到7. 2比較合適,並且需經常檢測ph 值。
五、培養空間
培養液與液面上的空間二者的體積比例一般以1∶10 為宜,培養液液面高度最好維持在2～5mm 的範圍,以便於氣體交換 。
六、恆溫培養箱
溫度應維持在37 ℃,co2 濃度為5 % ,o2 為95 % ,100 %的飽和濕度。
七、常見失敗原因
1. 汙染 汙染仍是細胞培養失敗的主要原因,包括細菌和真菌,中藥製劑尤易出現真菌汙染。支原體汙染不易發覺,但對細胞生長影響較小,尤其只培養72 小時。一般是分離過程中的用液和培養基出現了汙染。
2. ph 值 過高或過低,或培養過程中瓶塞不緊,co2 逸出,導致ph 值上公升。
3. 誘導劑 淋巴細胞在體內外一般是不**的,在培養過程中須新增刀豆球蛋白(cona) 、脂多醣(lps) 、白細胞介素2 ( il - 2) 、植物血凝素(pha) 、絲裂黴素等促**劑和抗原物質。須注意它們的濃度及是否失效。
4. 培養器皿洗滌不乾淨 有蠟、油汙或酸殘留。
5. 培養用液含有雜質 配製過程中所使用的各種溶液必須用三蒸水,若含有fe 、ca 等離子及雜質,可影響細胞的增殖 。
6. 接種的細胞數目過多或過少,或提取的淋巴細胞中混有大量紅細胞 。
7. 血清質量不佳。
8. 恆溫培養箱的co2 、溫度等不穩定。
9. 存在個體差異 在相同條件下,某一受試者的血培養不成功,而對照實驗培養結果正常,其原因有時無法查出.淋巴細胞的生長情況,還與受試物件的年齡有關,青年人的淋巴細胞比中、老年人的生長得要好。
一些培養心得：293t細胞差點被我養死，幸好我又將它起死回生，一點心得。
細胞傳代：當細胞在細胞培養瓶內長滿達到80％時就要傳代，一傳二，24小時後再傳代。48小時傳就不好了，如果在24小時後細胞沒有長到80％，應該換新的培養基，不然，培養基變黃，細胞脫落。
細胞消化：將細胞培養瓶豎立放置，吸走培養基，如果培養基中的脫落細胞較多，說明細胞現在很容易脫落，只要加入1ml的pbs+edta(0.02%)，來回輕微晃動培養瓶直到細胞完全脫落，加入10mlmem，混勻，不能吹打，分裝2瓶，如果細胞沒長滿就脫落，則只需加入5mlmem，不分裝。如果培養瓶中的細胞貼壁較牢固，培養基上清沒有細胞脫落碎片，且細胞長滿達到80％以上，吸走培養基，加入5ml的pbs+edta(0.02%)，迅速輕微晃動，豎立培養瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超過3min，細胞完全消化脫壁，取出加入10ml培養基輕微吸打混勻，分裝2瓶。
培養基：mem(gibco)+10%胎牛血清（杭州四季青）＋雙抗
問題 T 搜尋 細胞
題目描述 一矩形陣列由數字0到9組成，數字1到9代表細胞，細胞的定義為沿細胞數字上下左右還是細胞數字則為同一細胞，求給定矩形陣列的細胞個數。輸入用空格隔開的整數m，n m行，n列 矩陣 1 m，n 100 輸出細胞的個數。複製樣例資料 4 10 0234500067 1034560500 20456...
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