尼龍毛法分離淋巴細胞
試劑:
pbmc,1640(20ml),1640+10%fcs (50ml),75%醫用酒精(50ml)。
材料:
塑料軟管(0.5cm,15cm,飲料的吸管
也可,1支),尼龍毛(0.2g),5ml一次性注射器,(1支),高壓滅菌
用飯盒(2個),塑料平皿(1個),玻璃平皿(2個),玻璃試管
(5個)
方法:
準備尼龍毛柱:
一,處理尼龍毛,
1,0.2g尼龍毛,撕勻,
2,0.2mol/l hcl泡24h,
3,大量蒸餾水沖洗
4,平鋪玻璃皿,於乾燥
箱(50攝氏度)
5,烘乾(12h)後,高壓滅菌
二,處理吸管
1,1支吸管
2,0.2mol/l hcl泡24h,
3,大量蒸餾水沖洗
4,無菌飯盒內,烘乾
5,75%酒精沖洗,自然烘乾
三,組裝尼龍毛柱
1,超淨台內,酒精洗手2遍,
2,撕勻的尼龍毛,用長細棍(酒精燈沖洗自動鉛筆芯(0.5mm,10cm)引入尼龍毛於吸管中,毛位於吸管中部,兩端空出2cm,
3,5ml注射器吸取1640,注入吸管,浸透尼龍毛,
4,製備好的尼龍毛柱於滅菌飯盒,-20攝氏度儲存乙個月。
過柱(尼龍毛柱分離pbmc)
1,平衡毛柱:37攝氏度,1640+10%fcs,5ml,注入吸管(37攝氏度溫育待用)
2,注射器吸取1mlpbmc(2x107/ml,37攝氏度)垂直加入毛柱,再加入數滴(1640+10%fcs)
3,平放毛柱於滅菌飯盒內,37攝氏度,60min,
4,毛柱垂直放入10ml玻璃管,注射器吸取5ml,37攝氏度1640+10%fcs,緩緩注入毛柱(60滴/min)(手動控制)
5,洗脫液富含t細胞,離心棄上清,
6,毛柱放入第二玻璃管,10ml,37攝氏度1640+10%fcs,同樣洗滌
7,保留洗脫液,離心棄上清。(洗脫液中,t,b細胞均有,但純度不高)
8,毛柱放入第三支玻璃管,注射器吸取5ml,冰冷的1640+10%fcs,緩緩注入毛柱(且輕輕擠壓毛柱),洗脫液富含b細胞,離心棄上清。(冰冷的1640+10%fcs,降低b細胞的黏附性,擠壓下b細胞洗脫下來)