在二代測序領域，illumina測序平台以其核心的三項技術（分別是鹼基末端可逆修飾、橋式pcr和邊合成變測序策略），獨步天下。充分發揮了其鹼基讀取精確、通量提高、測序長度也穩步提高至雙末端各300bp。但是，任何測序技術面對各種測序需求總是會有些許不足，大白話說就是：沒有哪項技術可以解決全部的問題。那麼，illumina測序有哪些問題是需要注意的呢？我們就來聊聊這個話題。
問題一、測序過程中必須鹼基平衡
所謂鹼基平衡，是指，測序晶元上完成成簇反應之後，一定面積內的不同分子簇，各個位置的鹼基a、t、g、c分布均勻。這樣才可以較好的完成訊號轉換。如若不然，那麼對於鹼基的判讀就會出現錯誤，從而導致測序質量值大幅度下降。
反應在測序文庫上，就是一次測序反應中，應該盡量多新增諸如基因組dna文庫，rna轉錄組文庫，而少摻入一些擴增子文庫。這裡的擴增子文庫是指類似16s/18s/its可變區文庫。如果實在湊不齊文庫，那麼就應該認為摻入大量的平衡鹼基文庫。包括phix文庫、基因組文庫等。同時，也可以盡量多摻入不同型別的擴增子文庫。或者，對擴增子文庫的barcode序列做一些錯位（spacer）設計，增加鹼基的平衡性。
上圖即是平衡文庫和非平衡文庫測序資料差別，其中鹼基不平衡文庫曲線非常糟糕，資料質量會很差。
問題二、讀取長度受限
儘管目前illumina的測序讀長已經達到雙末端300bp，但是想要進一步提高測序讀長，還是非常困難的。主要的原因在於，第一，擴增測序的酶活性需要進一步提高太難。目前illumina miseq測序，完成一次測序，需要耗時超過60小時，加上文庫混合時間，還會超出這個時間。60小時內能維持酶的活性已經非常不錯了，再要提高就比較難。第二，基於單次只測乙個鹼基的邊合成邊測序原理，要求對各個分子簇的反應時間要求一致。也就是各個分子簇必須同時進行反應。理想狀態當然是如此，但是實際pcr反應過程中，各個分子的反應時間還是不盡相同的。因此，會產生有的分子簇內的分子反應的快，有的慢的情況（這種現象被稱作phasing，一般和酶活有關）。導致的結果就是，乙個分子簇內的訊號顏色不一樣。那麼越到測序後期，其鹼基判讀就越不準確。因此想要提公升讀長，illumina的增長潛力非常有限。解決問題的最終辦法還是要靠長度長的三代測序技術。
來自網路。
上圖較好的反映了phasing現象
問題三、文庫長度受限
文庫長度的意思是指，含兩側測序接頭和插入目標片段，整個文庫的長度範圍不能過寬，一般建議在250bp-450bp之間比較好，超過600bp以上就會造成一些不利影響。主要是短片段和長片段一起測序的時候，短片段的擴增效率一般都高於長片段的，因此更容易測到序列，長一些的文庫就不容易測到序列，導致資料產出有偏差。另乙個原因是，如果文庫片段過短的話，該短片段測序到後期，就是要測接頭序列了，有的時候連線頭序列都測完了，那就沒有訊號了，後續會讀取一些假訊號，降低測序質量值。
了解了上述問題之後，可以對我們日常測序進行指導，規避一些不必要的麻煩，提高測序文庫質量，同時提高測序質量及效率。
參考資料：
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