pacbio是目前測序長度最長的測序方法----平均讀長達到8kb。
原理：1. 用4種螢光分別標記4種dntp
2. 在測序晶元的底部做出許多用與入射光波長相應的小孔，特定的孔徑保證了入射光在小孔中只以走很短的矩離。只夠照到正好與酶在相互作用的螢光dntp底物
3. 把聚合酶錨定在測序晶元的底部
4. 讓dna鏈與酶結合，進行測序
5. 測序時，螢光dntp與酶+dna模板型成複合物，短暫結合
6. 螢光dntp被雷射照射，發出螢光，螢光被檢測到
7. 酶反應過程，一方面使鏈延伸，同時使dntp上的螢光基團脫落
8. 聚合反應持續進行，測序同時持繼進行
優點：1. 測長很長，主力的測長可以達到8kb，見下圖
2. 可以直接測出鹼基修飾，當聚合酶遇到模板上甲基化的a、c等鹼基時，聚合的速度明顯變慢，並且光譜特徵發生改變。這使直接測甲基化變得很容易，見下圖：
3. 對gc含量的偏向性小，可以輕鬆讀到高gc的區段，下圖中的紫色曲線就是pacbio的覆蓋度。從本質上說，是因為建庫中沒有pcr過程，所以也就沒有因為pcr而引入的gc bias
4. 測序速度快，上機時，1秒鐘測3個鹼基。3個小時可以完成乙個run。上機前的建庫，1天完成，與illumina或ion torrent的建庫時間基本持平。所以，整體上，1天建庫，1天上機，1天資料分析，3天可以走完乙個完整流程
缺點：鹼基的錯誤率：還是很高，達到12~15%。
錯誤的型別：主要是額外插入鹼基，同聚物（一串多個a、或c、或g、或t）區段尤其嚴重
錯誤的原因是：以讀a鹼基為例，軟體判斷是乙個a，還是二個a，是通過時間長短來確定的。而聚合酶與dntp結合的時間是呈指數遞減分布的，也就是半衰分布。所以判斷不准。當遇到同聚物時，軟體就更算不准，插入鹼基的可能性就會增加
錯誤的特點：隨機錯誤
錯誤的修正：因為是隨機錯誤，所以測序深度增加後，可以通過統計來修正錯誤。 另外，可以用illumina平台的高準確度序列來校正pacbio的序列
應用：de novo，因為讀長很長，所以在拼contig時，成功率很高，可以拼出很長的contig。並且可以輕鬆跨過重複序列、高gc序列。實際應用中，大家普遍用pacbio序列拼contig，再用illumina的序列來修正鹼基
hla分型，人體器官移植中，準確的hla分型很重要。hla是乙個長片段，而且單體型對配型成功、移植成功有重要意義。現在醫學上正在嘗試用pacbio的序列來為hla準確分型提供解決方案
甲基化研究。bisulfite是目前最常用的c鹼基的甲基化研究手段，但是操作很複雜、後續檢測也不算方便。pacbio可以直接讀出多種鹼基修飾，包括a的甲基化、c的甲基化、c的羥甲基化等，所以pacbio在鹼基修飾研究中，有著獨特的優勢
rna可變剪接研究。分析rna可變剪接的前提是乙個讀長序列要跨過可變剪接位點的兩側，而現有的別的測序方法，因為讀長較短，所以對rna可變剪接並不是很敏感。pacbio正好補上了這一塊，所以有一些專家在用pacbio研究可變剪接
檢測多個重複序列。有些疾病是因為一些重複序列的重複次數超過了正常的範圍，如脆性x-gene病中高達750個cgg重複，以往這些序列是很難通過直接測序測清楚的，現在科學家可以用pacbio直接測這些區段了
未來的發展方向：
更長的讀長
目前限制讀長的因素是：a.文庫發生切口，或都斷掉，導致模板鏈從酶上脫落；b.酶在雷射照射和螢光基因的作用下失活。
所以，未來要做更長的讀長: a.建立更長、更完整的文庫構建方法。b.或者採用合成效率更高的酶，讓單位時間內可以合成更多的鹼基；或者採用更耐雷射、螢光基團侵襲的酶；或者採用更好的螢光基因，有更好的螢光效率，以減少入射的雷射強度
更大的測序通量
目前的乙個smrt晶元約可以給出5萬條有用的reads，並得到約0.4g的有效資料量。
目前，總共是15個孔，酶落入孔中的分布呈泊松分布，約1/3的空孔，1/3的單個酶孔，1/3的多個酶孔；其中只有單個酶孔所產生的資料是有用資料
未來，pacbio會在增大每個smrt晶元的通量（read數）上下功夫
文庫形狀：
pacbio的文庫形狀很有趣，是乙個環，中間是測序插入片段，兩端是髮夾形的接頭，見下圖：
好處：可以周而復始地測序，充分利用pacbio的讀長
插入序列的正向鏈和反向鏈都可以被讀到，起到自我校正作用
兩端的已知接頭序列，可以用作計數器，用於計算模板被周而復始地測了幾次
國內服務費用：
建庫，試劑約￥4000，外包公司的建庫服務**約為￥8000~10000
上機，smrt測序晶元約￥4000，外包公司的服務**約為￥6000~8000
國內有pacbio的機構：
1. 中科院遺傳所
2. 醫科院北京藥植所
3. 上海南方基因中心（有公開服務）
4. 雲南動物所
5. 武漢鄧子新教授實驗室
6. 天津生物晶元中心（有公開服務）
7. 北京海克威爾公司
國際上提供pacbio服務的機構：
1. broad中心，乙個smrt run，賣$2500
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