距離上次《生信寶典》聯合《巨集基因組》組織的擴增子分析線下培訓結束己經有三個多月了。為方便廣大讀者的學習，現在開始陸續分享上次培訓的內部資料——理論課程課件。希望對想自學分析的朋友起到一定幫助作用。
首先講一下真菌的定義，真菌通常指的是真菌界的生物，是一類單細胞或多細胞異養真核微生物,無光合色素，細胞壁含幾丁質和纖維素。按功能劃分，可大致分為3類，病原菌、共生菌和腐生菌。真菌具有很高的物種多樣性，據估計全球大約150萬種，僅次於昆蟲，但是目前通過形態行鑑定的物種只佔 5-10%。因此，我們必須借助與分子生物學手段去研究真菌。那麼就涉及到pcr擴增，而pcr擴增最重要的就是引物的選擇。
從這張圖上我們可以看出，隨著分子生物學的發展，科學家們已經設計出了各種各樣的擴增真菌的引物，主要涉及小亞基、大亞基和its區。那麼這些引物到底有什麼區別？我們應該如何來選擇合適的引物呢？幾十年來，科學家一致致力於解決這個問題，一直希望找到一對只對真菌專一，而又不能擴增出其他類生物的引物。
前人為此做了很多相關的研究，結果發現：與細菌的小亞基不同，its區對真菌物種的區分度最高，從這張圖上我們也可以看出，對於同乙個樣品，its區能鑑定出的物種要明顯高於小亞基和大亞基，並且its2區要高於its1區。
在2023年荷蘭阿姆斯特丹舉行的第四屆國際條形碼大會上，全球真菌學家一致同意確定將its作為區分真菌的條形碼，
並於2023年發表在pnas上，its對區分所有真菌有72%的成功率。
擴增子分析可以方便快速的解決我們許多的科學問題，但是我們也不能忽視他的缺陷，例如引物的偏好性問題，往往導致導致資料與實際環境中不同。從此圖中我們可以看出，無論是its區還是小亞基大亞基區引物，採用擴增子分析時，與採用巨集基因組方法分析的結果都存在差異。所以選擇合適的引物進行擴增，對科研的開展尤為重要！儘管我們不能百分百的解決此問題，但是我們還是要盡量提高鑑定的精度
tedersoo2023年總結了前人的文獻之後，給出一些可供選擇的擴增真菌的引物。但是這些引物也不是盡善盡美，有些引物對真核生物專一，可能導致擴增出許多非真菌的序列，影響測序的序列數量。有些對真菌專一，又可能導致一些重要類群的丟失。
這是我們實驗室經過多年摸索確定的我們認為比較好的引物，我們之所以採用兩輪pcr是因為，土壤提取的dna太複雜，往往含有大量雜質，如果採用一輪的話，經常擴增不成功。最開始的時候，我們也是採用的its一區擴增，但是後來發現its2區的區分能力要好於1區，目前主要還是擴增2區。一輪引物可擴增its全長，二輪為針對特定區域的引物。後邊兩項為我們常用的反應條件和體系，需要提醒的一點是，大家還是需要做預實驗。
然後再給大家介紹兩對最新設計的引物，第乙個為talor 16年發表在aem上的，為5.8s-fun～its4-fun,目標區段為its2區
擴增子聚類之術語「 seed 」
前面的swarm聚類文章中講到過，seed 是 de novo 思想的演算法在聚類時，選擇的第乙個作為質心或起點的高丰度擴增子，它通常作為 cluster 的代表序列參與物種注釋等其它分析。從計算機角度來看 演算法的開始，建立乙個初始為空的資料庫，並在處理輸入序列擴充套件資料庫。對於每乙個 clus...
擴增子 巨集基因組測序問題集錦
擴增子 巨集基因組測序問題集錦 原文 諾禾致源，點我閱讀原文。作者整理的非常好，值得學習。但本人又結合自己經驗進行了修改，並對每個問題例舉了例項和新增自己的理解 個人經驗部分 微生物，是地球上最古老的生命形式之一，它們雖然微小，卻無處不在。隨著高通量測序技術的發展，測序成本逐步降低，測序通量飛速提高...
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