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高通量測序技術，就是二代測序，已經成為現代生物學研究的乙個較為常規的實驗手段。這一技術的發展極大地推動了基因組學，表觀基因組學以及翻譯組學的研究。rna-seq 通過測定穩定狀態下的rna樣品的序列來對rna樣品進行研究，從而避免了許多之前研究手段的不足，比如象基因晶元或者 pcr 就需要背景知識。而且 rna-seq 還可以觸及以前無法研究的領域，比如複雜結構的轉錄體。
rna-seq可以應用於以下幾個方面的研究，1. snps；2. novel transcripts；3. alternative splicing；4. rna editing。但歸根結底，rna-seq最主要的分析還是篩選差異基因。
常用的rna-seq操作平台有illumina ga/ hiseq, solid 還有roche 454。它們都是提取rna後，純化，打碎，逆轉錄成cdna，然後測序。測序的結果被稱為short reads。通常乙個reads的長度為25-300bp之間。如果測序只測一端可能會帶來比對時的困難，於是這些操作平台提供了兩端都測的辦法，這樣的結果成對出現，中間有一定的間隔，但是因為測序長度一下子提高了一倍，所以比對會精準很多。人們把這種測序結果稱為』paired-end』 reads。一般來講，測序結果會直接轉換成一行一行的由字母組成的短序列，可以是fasta,fastq等不同格式。
然而，這一技術產生的海量資料分析卻給生物學家帶來了難題。乙個測序的結果檔案少則幾gb，多則幾十gb，單獨對比拼接，就會用去幾個小時，而後再得出差異表達的結果，其耗時耗力，並非實驗生物學家可以應付得了的。於是生物資訊學的研究人員努力做出一些軟體，以降低結果分析的難度。但是，即使這樣，還是必須對分析過程有個較為細緻地了解，才能正確地使用這些軟體，從而得到比較接近事實的結果。
一般的來講，rna-seq後de的工作流程是這樣的（圖1），首先，將短序對映到基因組相應的位置上去，其次，對對映的結果進行基因水平，外顯子水平，以及轉錄水平的拼接，而後對結果進行資料統計，標準化之後生成表達水平報告檔案，最後由生物學者依據系統生物學相關知識，來對資料結果進行分析。
rna-seq分析工作流程
不同步驟涉汲的軟體和方法：
分析步驟
方法軟體
general aligner
gmap/gsnap
bfast
bowtie
cloudburst
gnumap
maq/bwa
perm
rzaers
m***st/mrsfast
soap/soap2
shrimp
de novo annotator
splicemap
soapals
g-mo.r-se
tophat
splitseek
de novo transcript assembler
qases
mira
summarization
isoform-based
cufflinks
alexa-seq
gene-based
count exons only
exon junction libraries
normalization
library size
erange
tmm: trimmed mean of m-values
edger
upper quartile
myrna
differential expression
poisson glm (generalized linear model)
degseq
myrna
negative binomial
edger
deseq
bayseq
systems biology
gene ontology analysis
goseq
第一步的工作是alignment。對於rna-seq 的 alignment，從來都不是一件容易的事情。其難點如下：
沒有很好的比對模板。現在的比對模板都是基因組模板，而不是真正的轉錄組模板，也就是說，這對本來就不是很長的短序來說，它很有可能是界於兩個 exon之間。我們在比對junction的時候，一般還是假設它如果沒能在基因組模板中找到合適的位置的時候，才考慮它是否是界於junction上。這種人為的假設可能並不準確。
snps，鹼基插入，刪除，錯配，或者質量不高的測序結果，從模板至比對序列本身，都存在著比基因比對更為複雜的問題。
reads 可能會有多個100％的匹配位點。
有些基因組可能需要龐大的記憶體空間。
為了解決最後乙個問題，人們使用了很多辦法，但基本上都會基於事先建立的引索庫。即所謂「啟發式」比對(heuristic match)。首先使用一定長度的（通常是11個鹼基）的序列做為索引用的關鍵字，在匹配這一索引字之後，就很大程度地縮小了其需要匹配的模板範圍。但是這一辦法的問題在於不容易解決問題2中的空格，錯配問題。所以在很多軟體使用時，會要求人工確認高保真區，以及最高允許2-3個錯配。
現在比較快的「啟發式」比對主要有兩種演算法，一種是雜湊表(hash table)，一種是bw壓縮轉換(burrows wheeler transform, bwt)。前者速度快，但是對記憶體要求比後者要高。
對於問題3，一般而言，大部分軟體使用的辦法是只保留乙個匹配位點，其中，有些是只保留第乙個匹配位點，有些是按照概率分布選取保留的位點。當然，前面已經提到過，可以使用paired-end read來盡量避免問題3的出現。
對於問題1，可以使用外顯子庫來確定junction reads。有兩種辦法，一種是依靠已知的外顯子庫來構建，另一種辦法就是依據已經匹配好的短序來構建外顯子庫(de novo assembly of transcriptome)。後者的不足是運算量大，對測序覆蓋範圍要求高，最好是使用paired-end reads。
這一步，主要是基本於不同水平（外顯子水平，轉錄水平，或者基因水平）進行統計。最簡單的辦法就是統計落在每個外顯上的 reads 數。但是有研究表明，很多（可能超過15％）的 reads 會落在外顯子兩側，這會影響統計的結果。另一種辦法就是統會落在內顯子區域的 reads 數。
標準化對於樣品內及樣品間的比較而言是非常重要的。標準化被分為兩類，樣品內及樣品間（between- and within-library）。
而對於樣品間標準化，最簡單而直接的辦法使用 reads 總數來平衡表達量。然而 reads 總數受測序深度的干擾，而且單個基因的短序數與實際的表達量並不一定會呈線性比較關係。一些研究者推薦使用 quantile normlization，但是有研究說這一辦法並沒有實際的價值。還有提出使用對數分布法則(power law distributions)來進行樣品間標準化。但沒有研究對這一處理方式進行驗證。
差異表達分析的最終目的是篩選差異表達的基因（外顯子等等）。最終的結果顯示一般來說是**化的，這一**按照一定的規則排序，讓人們能夠盡可能簡單地拿到想要的結果。
由於 rna-seq 結果的離散性，人們一般都會使用統計模型來擬合實驗得到的結果。一般而言，rna-seq的結果是比較附合伯松分布 (poisson distribution)的。這一結果得到了單通道illumina ga測序結果的實驗驗證。但是，伯松分布分析結果常常在多組重複的樣品間帶來較高的假陽性，因為它低估了生物取樣的樣品間誤差。所以rna-seq如何設定重複是乙個很重要的問題。為了平衡重複樣品所帶來的誤差，人們使用了serial analysis of gene expression (sage) data。
現有的軟體一般都是針對較為簡單的實驗設計的。而對於複雜的實驗設計，比如說成對樣品，時間依賴樣品等等，還沒有專門的，較好的解決方案。大多數都使用edger的線性模型來進行分析。
簡單地講，前景是廣闊的，但目前為止手段還是比較有限的，基本上就是go分析
from rna-seq reads to differential expression, oshlack et al. genome biology 2010.
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RNA seq分析流程
高通量測序知識 fastqc使用，相對應的r包fastqcr，rqc fastp biostrings包計算gc含量，q20等 library biostrings filepath system.file extdata s 1 sequence.txt package biostrings qd...
RNA seq的典型流程（protocol）
一 rna的分離 從新鮮的或者是冷凍的細胞或組織樣本中分離rna，一般情況下，樣品會被dna汙染。因此，在製備文庫之前，會使用dna酶 降解dna 降解rna樣品中的dna汙染。二 rna的質量檢查 在後續分析的時候也有質控這一步，不過是從測序質量這個層面的質量 在製備文庫之前，要在rna降解，純度...
RNA Seq分析筆記（2）
檔案分割 使用下面命令將srr分割開來。fastq dump gzip split 3 srr3589956.sra done生成之後，結果如下 biochem qcgate step3 hisat2 ls gz l rw rw r 1 biochem biochem 1223462176 nov ...